-
میکروسکوپ کانفوکال به نوعی میکروسکوپ نوری ویژه اشاره دارد که می تواند برش های نوری را ضبط کند.
با روشنایی و مشاهده یک نقطه محدود پراش ، برش نوری در یک سیستم کانفوکال لیزر تحقق می یابد. این امر مستلزم آن است که دو بخش پرتو تمرکز یکسانی داشته باشند ، بنابراین آنها "کانفوکال" هستند. برخلاف تصاویر مزارع گسترده ، تصاویر کانفوکال هیچ تاری محفوظی ندارند. این به خودی خود یک مزیت است ، زیرا تصویر عمیق نمونه از نظر جزئیات واضح و غنی است. با این حال ، مهمترین مزیت پتانسیل تجسم سه بعدی آن با ویژگی های میکروسکوپی است. پس از به دست آوردن دنباله تصویر در امتداد Z-Stack ، شیء سه بعدی توسط رایانه بازسازی و نمایش داده می شود.
- روشنایی کانفوکال
روشنایی منبع نور نقطه با تمرکز منبع نور بر روی یک دیافراگم کوچک (سوراخ سوراخ) و سپس تمرکز آن بر روی نمونه تحقق می یابد. هنگامی که دیافراگم به اندازه کافی کوچک است ، نقطه روشنایی فقط با پراش محدود می شود ، نه با پارامترهای هندسی منبع نور و دیافراگم. منبع نور معمولی یک منبع نور سطح بزرگ است ، بنابراین غیرممکن است که آن را بر روی نقطه حد پراش متمرکز کنید. بنابراین ، اگرچه انتقال بسیار کم است ، اما این نوع نور روشنایی متمرکز هنوز بسیار ضروری است (برای منابع نور سنتی).
شکل 1: روشنایی برای تصویربرداری کانفوکال. نور از منبع نور (LS) بر روی سوراخ روشنایی (PI) متمرکز شده و سپس وارد نمونه S می شود.
لیزر به عنوان منبع نور دارای برخورد بسیار بالایی است (نور در لیزر خوب "بسیار موازی" است). بنابراین ، لیزر را می توان از طریق یک لنز واحد بدون استفاده از سوراخ سوراخ بر روی یک نقطه محدود پراش متمرکز کرد. بنابراین ، بیشتر میکروسکوپ های کانفوکال هیچ سوراخ روشنایی ندارند. کیفیت نقطه نور به کیفیت پرتو لیزر بستگی دارد. اگر کیفیت خوب نیست ، می توانید سوراخ روشنایی را نیز وارد کنید. لیزر معمولاً از طریق فیبر نوری با میکروسکوپ کانفوکال همراه است. این فیبرها نیز به عنوان سوراخ سوراخ عمل می کنند.
کانونی و چگالی انرژی زیاد لیزر آن را به یک منبع نور ایده آل برای میکروسکوپ کانفوکال تبدیل می کند. انسجام لیزر ویژگی مورد نیاز عملکرد کانفوکال نیست. در مقابل ، این یک چالش برای طراحان نوری است ، زیرا این امر باعث ایجاد الگوهای تداخل کاذب خواهد شد ، بنابراین استراتژی های طراحی دقیق مورد نیاز است.
علاوه بر این ، این واقعیت که لیزر سنتی فقط یک رنگ واحد (لیزر "خط") منتشر می کند ، محدودیت های خاص خود را دارد. در تصویربرداری و اندازه گیری چند فلورسانس ، چیدمان پیچیده چند لیزر مورد نیاز است. لیزر سفید به طرز ماهرانه ای مشکل تصویربرداری چند رنگ را حل می کند.
شکل 2: مقایسه کانفوکال (منطقه راست) و تصویربرداری غیر کنفرانس. در تروفوبلاست ماوس رنگ آمیزی شده Feulgen. اطلاعات زیادی از تصاویر غیر کنفرانس از هواپیمای کانونی حاصل نمی شود. اپتیک کانفوکال تمام عوامل فازی را از بین می برد و ساختار را روشن می کند.
تشخیص کانفوکال
بیشتر آشکارسازها دارای یک منطقه حساس نسبتاً بزرگ هستند (لوله های فوتوموپلی معمولاً چندین سانتی متر مربع هستند). اپتیک کانفوکال نیاز به سنجش نقطه دارد. بنابراین ، لازم است با قرار دادن یک دیافراگم کوچک (سوراخ سوراخ) در پرتو نور ، تشخیص نقطه را انجام دهید. با تمرکز نور نمونه بر روی سوراخ سوراخ ، جمع آوری و ضبط نور منتقل شده.
از آنجا که الگوی پراش به دیافراگم عددی و طول موج بستگی دارد ، تشخیص سوراخ سوراخ لازم است. بنابراین ، هنگامی که این پارامترها تغییر می کنند ، اندازه سوراخ سوراخ باید تنظیم شود.
هنگامی که لنزهای عینی تغییر می کنند (معمولاً با تغییر دیافراگم عددی) ، میکروسکوپ اسکن کانفوکال مدرن به طور خودکار قطر سوراخ را به طور مناسب تغییر می دهد. بنابراین ، سوراخ ها معمولاً به عنوان دیافراگم دو لایه یا چند لایه طراحی می شوند.
در حقیقت ، اندازه مناسب سوراخ سوراخ نه تنها به طول موج و دیافراگم عددی بستگی دارد ، بلکه به بزرگنمایی داخلی عناصر نوری در میکروسکوپ نیز بستگی دارد.
بنابراین ، مقایسه مستقیم قطر سوراخ سوراخ در میکروسکوپ ها با طرح های مختلف نه تنها نامطلوب بلکه اشتباه است. اگر قطر سوراخ سوراخ به مقدار بهینه تنظیم نشده باشد ، سیستم قادر به انجام برش نوری به آرامی نخواهد بود (یعنی انتقال Blur Defocus) یا قطع شدت غیر ضروری بدون به دست آوردن کیفیت برش نوری بیشتر (در نتیجه تصاویر سر و صدای غیر ضروری).
شکل 3: تشخیص در تصویربرداری کانفوکال. نور از نمونه S بر روی سوراخ مشاهده (PO) و سپس در ردیاب DE متمرکز شده است.
مسیر نوری اسکن کانفوکال
مسیر پرتو کانفوکال در سیستم اسکن کانفوکال تنها ترکیبی از روشنایی منبع نقطه و تشخیص نقطه است. این ترکیب می تواند به عنوان یک چاقوی نوری استفاده شود. فقط فوتون های موجود در صفحه کانونی می توانند به سنسور منتقل شوند. در حالی که تمام فوتون های مکان های دیگر فیلتر می شوند. برش نوری با استفاده از "فیلتر مکانی" تحقق می یابد.
از آنجا که تنها یک نقطه تصویربرداری "کانفوکال" در یک زمان معین به نظر می رسد ، یک دستگاه اسکن برای جابجایی نقطه در قسمت شیء در حالت شبکه لازم است. معمولاً آینه نوری روی موتور اسکن نصب شده و برای اجرای روش اسکن استفاده می شود. در زمان لازم برای اسکن یک قاب کامل (معمولاً) 1،024 خط ، یک تنگنا وجود دارد. با معرفی یک اسکنر با سرعت بالا (اسکنر رزونانس) که 8 ، 4 {4}}} یا بیشتر در ثانیه را اسکن می کند ، پیشرفت هایی حاصل شده است.
فقط در زیر فناوری میکروسکوپ نور منعکس شده می توان یک برش نوری خوب حاصل کرد. این یکی از دلایل رشد شدید میکروسکوپ فلورسانس در 20 سال اخیر است (دلایل دیگر شامل اختراع ایمنی ، DNA- هیبریداسیون ، بیوسنسور فلورسنت ، نقاط کوانتومی و پروتئین فلورسنت) است.
شکل 4: از چپ به راست: 1. مخروط روشنایی نه تنها رنگ فلورسنت را در صفحه کانونی تحریک می کند ، بلکه آن را به بالا و پایین هیجان زده می کند. در اینجا توسط یک مخروط دوتایی سبز نشان داده شده است. 2. سوراخ انتشار به طور مؤثر نور ساطع شده از بالای صفحه کانونی را رهگیری می کند. علاوه بر این ، نور از زیر هواپیمای کانونی از سوراخ سوراخ عبور نمی کند. 4. در سیستم کانفوکال ، فقط نور از نمونه به ردیاب می رسد. تشخیص سوراخ ها به طور موثری هرگونه نور را از مناطق دیگر رد می کند. سرانجام ، بخش نوری واقعی به دست می آید.
